Il laboratorio*
*Relazione da: L'HPV e il vaccino a 2 anni dall'esordio. II Incontro Ospedale Cristo Re. Roma, 19 giugno 2009
Il Papillomavirus è un virus a DNA della famiglia dei PapovaVirus. Capside nudo composto da 72 capsomeri a simmetria icosaedrica con un diametro compreso tra i 45 – 55 nm. Contiene un DNA a doppia elica (8000 bp) organizzato in sequenze nucleotidiche (ORFs) distinte in: geni L (L1-L2) che codificano per proteine strutturali del capside virale e geni E (E1-E7) che codificano per proteine regolatrici la replicazione del DNA virale. Gli HPV hanno un tropismo selettivo nei confronti di cellule degli epiteli squamosi e delle mucose.
Gli HPV che infettano l’epitelio cervico-vaginale si dividono in: HPV a basso rischio e HPV ad alto rischio.
Nelle lesioni benigne il virus è presente in forma episomiale ed in copie multiple, il DNA virale si integra con il DNA della cellula ospite.
L’azione oncogena del virus is manifesta attraverso il processo di inattivazione di alcune molecole regolatrici del ciclo cellulare che, in condizioni normali funzionano come freno inibitore per la proliferazione cellulare,queste proteine sono: p53 prodotto del gene oncosoppressore omonimo e p105 Rb, prodotto del gene del retinoblastoma.
La proteina virale E6 è caratterizzata da una particolare affinità di legame per p53 che ne causa la degradazione; la proteina virale E7 si lega con alta affinità alla Rb determinandone il suo sequestro.
Venendo meno l’azione di blocco mediata da p53 e Rb il virus può replicarsi con l’ausilio degli enzimi cellulari e propagarsi attraverso la lisi della cellula ospite in oltre viene perso il controllo del ciclo cellulare da parte della cellula ospite.
TEST di LABORATORIO PER LA DETERMINAZIONE DELL’ HPV DNA
I test di laboratorio più utilizzati sono:
INNO-LiPA Hpv genotyping extra (Innogenetics)
Si basa su una amplificazione di acidi nucleici (PCR) con il principio della ibridazione inversa.
Il kit identifica 28 genotipi diversi: HPV alto rischio: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,
59, 68, 73, 82; HPV basso rischio: 6, 11, 40, 43, 44, 54, 70; HPV probabile alto rischio: 26, 53,
66, 69, 71, 74.
Il test prevede 4 fasi principali:
a. Estrazione del DNA su colonnine di eluizione da campioni di cellule cervicali raccolti su terreni liquidi PreserCyt® e SurePath®
b. Amplificazione del DNA target mediante primer consensus che abbiano come bersaglio una regione del genoma conservata tra i vari genotipi: frammento di 65 bp della regione L1.
c. Ibridazione degli amplificati con le sonde nucleotidche fissate su striscia
Il test Hybrid Capture ® (hc2) del DNA dell’HPV di Digene
• L’unico test commerciale attualmente disponibile in grado di offrire una standardizzazione globale con risultati altamente riproducibili.
• La tecnologia di amplificazione del segnale utilizza la chemiluminescenza per la rilevazione del DNA virale
• In grado di distinguere tutti i 13 tipi di HPV cancerogeni e i 5 tipi virali a basso rischio
• Tipi di HPV a rischio alto/intermedio 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68
• Tipi di HPV a basso rischio 6, 11, 42, 43, 44
Quando è indicato utilizzare l’HPV DNA test nella diagnosi del cervico- carcinoma?
E’ in discussione se utilizzarlo nello screening.
E’ considerato utile nelle linee quida delle maggiori Società Scientifiche nella diagnosi differenziale in lesione in donne con Pap-Test dubbio (ASC-US, ASC-H, Pap da ripetere, ecc.)
E’ considerato utile nelle linee quida delle maggiori Società Scientifiche considerare la presenza di DNA/RNA virale nel follow up di pazienti trattate (HSIL)
TEST di LABORATORIO PER LA DETERMINAZIONE DELL’HPV RNA
Tramite la ricerca dell’ mRNA con la tecnica NASBA si rileva :
1. Presenza del Papillomavirus
2. Presenza dell’espressione oncogenica dell’HPV (espressione E6 ed E7)
3. Il genotipo di Papillomavirus
La determinazione dell’HPV RNA in campioni DNA HPV ad alto rischio positivi consente queste ulteriori informazioni:
La presenza dell’ RNA indica che il virus non solo presente ma sta esprimendo le sue proteine oncogeniche
La persistenza dell’espressione oncogenica di HPV è uno dei più importanti fattori associati al rischio di sviluppo del cancro della cervice.
La determinazione dell’RNA è quindi in grado di fornire indicazioni sulla persistenza e sulla valutazione del rischio di sviluppo del cancro della cervice nel follow up di pazienti trattate per HSIL.
BIBLIOGRAFIA
1. M.von K Doeberitz. New markers for cervical displasia to visualize the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur. J. Cancer. 2002; 38, 2229-2242
2. MAE Nobbenhuis et al. Addition of high risk HPV testing improves the current guidelines on follow up after treatment for cervical intraepithelial neoplasia. B.J.Cancer 2001;54, 795-801
3. KS. Cuschieri et al. Human Papillomavirus type specific DNA and RNA persistence-implications for cervical disease progression and monitoring.J. Med.Virology 2004; 9999, 1-6
4. T Molden. et al. Human papillomavirus E6/E7 mRNA expression in women younger than 30 years of age. Gynecol Oncol. 2006; 100, 95-100
Prof.ssa Deborah French
Università degli Studi di Roma “ Sapienza”-Dipartimento di Medicina Sperimentale
U.O.C. Diagnostica Cellulare Ospedale Sant’Andrea
